В настоящее время разработано множество модификаций способа теплового демаскирования антигенов. Общим для них является прогрев срезов, приклеенных к предметным стеклам, в водных растворах до температуры 95 – 100 °C, а в отдельных случаях – и до 120 °C при повышенном давлении.
5.2. Растворы, применяемые для теплового демаскирования антигенов
С учетом эмпирически установленных особенностей процесса демаскирования в качестве растворов могут быть использованы водные растворы солей различных металлов и буферные растворы при различных pH. Считается, что, помимо гидролиза межмолекулярных связей, образованных благодаря действию фиксаторов, эффективность теплового демаскирования зависит от полноты удаления из срезов ионов кальция. Это достигается введением в буферные растворы солей лимонной кислоты или этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, Трилон Б).
Для теплового демаскирования антигенов разработано множество рецептов буферных растворов. В большинстве случаев (если только нет указаний о непригодности этого раствора в аннотации к конкретным антителам) можно применять цитратный буфер (рН = 6,0). По мнению D. J. Dabbs (2006), при отсутствии специального буфера можно использовать дистиллированную воду без добавок. Эффективность демаскирования антигенов в дистиллированной воде ниже, чем при использовании специальных буферных растворов. Наш опыт свидетельствует о том, что при демаскировании антигенов в дистиллированной воде развивается неспецифическое фоновое окрашивание срезов, которое мешает идентификации иммунореактивных структур. Учитывая простоту приготовления цитратного буфера, в общих случаях для демаскирования лучше использовать именно этот раствор.
Как правило, производители первичных антител указывают на необходимость проведения теплового демаскирования для материала, фиксированного в формалине и залитого в парафин, то отмечают, в каком буфере следует производить демаскирование. Наибольшее распространение получили три буферных раствора, применяемых для демаскирования в том случае, когда оно действительно необходимо. Кроме упомянутого цитратного буфера (рН = 6,0), это EDTA-буфер (pH = 8,0) и Tris-EDTA (pH ≈ 10,0). Ряд производителей антител рекомендует для обработки свои оригинальные буферные растворы (например, S-1700 (Dako), CC1 и CC2 (Roche-Ventana), Bull’s Eye Decloaker (Biocare) и др.