После длительной борьбы с администрацией Военно-медицинской академии (отношения с которой стали натянутыми после его реакции на увольнение Циона) Павлов в 1883 г. защитил диссертацию на соискание степени доктора медицины, посвященную описанию нервов, контролирующих функции сердца. Он был назначен приват-доцентом в академию, но вынужден был отказаться от этого назначения в связи с дополнительной работой в Лейпциге с Гейденгайном и Карлом Людвигом, двумя выдающимися физиологами того времени. Через два года Павлов вернулся в Россию.
Многие исследования Павлова в 1880-х годах касались системы кровообращения, в частности регуляции функций сердца и кровяного давления. Наибольшего расцвета творчество Павлова достигло к 1879 г., когда он начал исследования по физиологии пищеварения, которые продолжались более 20 лет. К 1890 г. труды Павлова получили признание со стороны ученых всего мира. С 1891 г. он заведовал физиологическим отделом Института экспериментальной медицины, организованного при его деятельном участии. Одновременно он оставался руководителем физиологических исследований в Военно-медицинской академии, в которой проработал с 1895 по 1925 г. Будучи от рождения левшой, как и его отец, Павлов постоянно тренировал правую руку и в результате настолько хорошо владел обеими руками, что, по воспоминаниям коллег, «ассистировать ему во время операций было очень трудной задачей: никогда не было известно, какой рукой он будет действовать в следующий момент. Он накладывал швы правой и левой рукой с такой скоростью, что два человека с трудом успевали подавать ему иглы с шовным материалом».
В своих исследованиях Павлов использовал методы механистической и холистической школ биологии и философии, которые считались несовместимыми. Как представитель механицизма, Павлов считал, что комплексная система, такая, как системы кровообращения или пищеварения, может быть понята путем поочередного исследования каждой из частей; как представитель «философии целостности», он чувствовал, что эти части следует изучать у интактного, живого и здорового животного. По этой причине Павлов выступал против традиционных методов вивисекции, при которых живые лабораторные животные оперировались без наркоза для наблюдения за работой их отдельных органов.