Летом 1839 года по дороге на богомолье в Троице-Сергиеву Лавру Александр заехал за советом к троекуровскому затворнику Иллариону, и старец сказал ему: «Иди в Оптину, ты там нужен».
Вернувшись в Липецк, Александр продолжал еще сомневаться, пока не решился окончательно в октябре 1839 года, уйдя из дома в Оптину тайно от всех.
Приехав в Оптину Пустынь, Александр пошел к старцу Льву, который с христианской любовью принял Александра и благословил первое время жить в гостинице и переписывать книгу о борьбе со страстями «Грешных спасение» (перевод с новогреческого). 2 апреля 1840 года его зачислили в число братии монастыря и одели в подрясник. Первое время послушник Александр был келейником и чтецом у преподобного старца Льва, затем работал в хлебне, варил хмелины (дрожжи), пек булки. Но недолго ему пришлось пожить в монастыре: в ноябре 1840 года его перевели в скит помощником повара, где он и трудился в течение года. Работа отнимала большую часть дня, и ему мало приходилось бывать на богослужениях, что и приучало его к внутренней непрестанной молитве.
Преподобный старец Лев перед своею кончиной, передавая послушника Александра преподобному старцу Макарию, сказал: «Вот человек больно ютится к нам, старцам. Я теперь уж очень стал слаб. Так вот я и передаю тебе его из полы в полу, владей им, как знаешь».
С осени 1841 года по 2 января 1846 года послушник Александр был келейником у преподобного Макария. Он помогал старцу в обширной переписке, что впоследствии помогло и ему самому при духовном окормлении многочисленной паствы.
Летом 1841 года послушник Александр был пострижен в рясофор, а 29 ноября 1842 года – в мантию с именем Амвросий в честь святителя Амвросия Медиоланского. 4 февраля 1843 года монаха Амвросия рукоположили в иеродиакона, а 9 декабря 1845 года епископом Николаем Калужским он был рукоположен в иеромонаха. Практически сразу после посвящения о. Амвросий тяжело заболел. В октябре 1846 года он был тайно пострижен в схиму с сохранением прежнего имени и вскоре был вынужден по состоянию здоровья выйти за штат монастыря и стал числиться на иждивении обители. С тех пор он не мог совершать Литургии, так как был очень слаб. Лечение не помогало, болезнь затягивалась. Но тяжелая и продолжительная болезнь была явным действием Промысла Божия: ему открывался путь духовничества и старчества. Еще при жизни преподобного Макария, с благословения старца, некоторые из братии приходили к отцу Амвросию для откровения помыслов. Так старец Макарий постепенно готовил себе достойного преемника.