Среди донских казаков была сильная прослойка населения татарского происхождения, хотя дать точное определение такому понятию затруднительно. Во время княжения Василия III среди атаманов были известны многие с татарскими именами, в большем количестве среди верховых казаков. Со времени распада Золотой Орды и перехода казаков в положение независимого быта, татары и казаки сильно перемешивались. Но ко времени начала царствования Иоанна Васильевича во главе донских казаков, как верховых, так и низовых, становятся известными атаманы исключительно с русскими именами.
В 1538 году мирза Приволжской Ногайской Орды Кель-Магмет жаловался в Москву на обиды, чинимые ему городецкими, мещерскими и другими казаками. Боярская Дума именем царя уклончиво отвечала ему: «на Поле ходят казаки многие – казанцы, азовцы, крымцы и иные баловни казаки, а и наших украин казаки, с ними смешавшись, ходят. И те люди, как нам, так и вам, тати и разбойники; а на лихо их никто не учит: сделав какое лихо, разъезжаются по своим землям». Бессильная в то время Москва иначе и не могла ответить, а потому всегда прибегала к такой двойственной политике, втайне радуясь успеху казацкого оружия. Это, так сказать, были первые, нерешительные наступательные действия необъединённого ещё восточного казачества.
До середины XVI столетия Дон ещё представлял арену для казацких турниров с астраханскими и крымскими наездниками, с переменным счастьем для тех и других. В целом, можно сказать, черкасское, северское, белгородское и старое азакское/азовское казачество в этот период времени хранило грозное молчание и только соединилось в одну общую семью, чтобы вскоре одним дружным натиском дать отпор сильному и зазнавшемуся врагу. Эта грозная сила в конце первой половины XVI века двинулась лавиной на берега родного ей Дона и своим внезапным появлением обескуражила, смутила и навела страх на весь мусульманский мир.
Малолетство царя Иоанна IV Васильевича было временем господства князей и боярства. Связь донских казаков с Москвой во время боярского правления не прекращалась. Они продолжали сопровождать послов между Москвой и Крымом, и поддерживали церковную связь с епископом своей епархии Крутицким.
В сторону Казани и Поволжья верховые казаки имели сильную заставу, существовавшую ещё со времени Батыя, получившую название впоследствии «волжских казаков». На Переволоке между Доном и Волгой, в сторону Большой Ногайской Орды и Астрахани, находилась ещё одна постоянная застава.