Мазепа плетет интриги против Москвы. Русский царь получил донос, но не придал ему большого значения. О доносе узнает и сам Мазепа. Оправдываясь перед Петром Первым, он убеждает его в своей невиновности и требует казнить доносчика – своего бывшего друга и отца своей возлюбленной – Кочубея. Любящая Мария еще не знает страшную тайну. Обиженная холодностью Мазепы, она расспрашивает его, и в конце концов гетман признается ей в планах восстания против владычества Москвы. Мария гордится, ей по душе представлять возлюбленного в царском венце. Этого мало: Мазепа желает получить однозначный ответ на страшный вопрос: если придется выбирать между отцом и возлюбленным, чью смерть она выберет? И вот долгожданный ответ получен.
В замке в Белой Церкви сидит в цепях Кочубей и ждет смерти. Его угнетают мысли о том, что ему некому завещать свою месть обидчику. В пытках принужден он был сознаться в своем коварстве, хотя на самом деле он невиновен. Отдых последней ночи опять нарушен – пришел кровожадный Орлик, узнать, где спрятаны сокровища Кочубея. Мазепа не находит покоя, и эту ночь проводит без сна. Его мучат мысли, что скоро Мария узнает обо всем.
Под утро в спальню девушки прокралась мать. Она открывает Марии страшную тайну и умоляет просить Мазепу пощадить отца. Мария потрясена, долго не может понять, что происходит, ведь она до сих пор была в неведеньи.
В это время на поле привозят Кочубея и Искру, палач рубит им головы. Народ постепенно расходится. Тут появляются две женщины, они бегут к месту казни, но им говорят: поздно. После этого Мария исчезает, слуги гетмана не могут нигде ее найти.
Мазепа переходит на сторону Карла, наступает час действовать, и он готов поставить свои полки против Петра. В ночь накануне битвы Мазепа в разговоре с Орликом признается, что Карл не кажется ему достойным противником Петра, что он больше не уверен в нем. Но и перейти обратно на сторону русского царя он не хочет – Мазепа мстит за старую обиду, когда на пиру Петр схватил его за усы.
Начинается Полтавская битва, где превосходство принадлежит русским. На Мазепу совершается покушение – молодой казак мчится на него с саблей. Казак подстрелен, и перед смертью он шепчет имя Марии. Петр одержал в битве верх, он пирует в шатре. А Мазепа и Карл скачут верхом, спасаясь бегством. Они оказываются в хуторе, откуда Мазепа увел Марию. Здесь он и встречается с ней – Мария сошла с ума и не узнает его.