Неожиданное несчастье в 1649 году прервало учение: один за другим быстро умерли отец Мальпиги, мать и бабушка (мать отца). Как старшему сыну Марчелло пришлось ехать в Кревалькоре устраивать дела своей многочисленной осиротевшей семьи (у него было четыре брата и три сестры). Похлопотав некоторое время, Марчелло оставил дела завершать своему дяде, а сам вернулся в университет. Следующим предметом была метафизика, которую он изучал под руководством иезуитского патера Готтарда Беллони. По совету своего первого учителя Натали Марчелло избрал для специализации медицину, в которой его более всего привлекала анатомия. На медицинском факультете его основными учителями были: по анатомии Бартоломео Массари, а по клинической медицине – Андреа Мариани.
Пройдя обучение в университете, Марчелло в 1653 году защитил диссертацию на степень доктора медицины. Спустя три года ему поручили чтение лекций по медицине в Болонской высшей школе (Archiginnasio), но его враги и завистники, одним из которых был профессор теоретической медицины Монтальбани, до того отравляли ему жизнь своими преследованиями, что он охотно принял предложение герцога Тосканского Фердинанда II занять вновь учрежденную кафедру теоретической медицины в Пизе. В конце 1656 года экстраординарный профессор Мальпиги приступает к чтению лекций.
В доме профессора математики Альфонсо Борелли, с которым сблизился Мальпиги, анатомы производили вскрытия животных. Великий герцог Тосканский Фердинанд и принц Леопольд присутствовали при анатомических вскрытиях и вообще относились к происходящему в кружке с живейшим интересом. В дальнейшем они приглашали ученых во дворец для демонстраций. Благодаря интересу правящих лиц к анатомии и физиологии, в 1657 году возникла Экспериментальная академия, основанная принцем Леопольдом и приобретшая впоследствии большую известность.
В этот период Мальпиги ведет исследования над природой крови, пишет работы о моче, о действии слабительных, о пищеварении. Однако работа его прерывается известием о распре, разгоревшейся между его братом Бартоломео и соседним семейством Сбаралья, владения которого граничили с землями семейства Мальпиги в Кревалькоре. Этой сваре, сделавшейся хронической и принявшей весьма резкие формы, суждено будет часто вторгаться в жизнь ученого. Отчасти по нездоровью, частично из желания быть поближе к своему дому и родне Мальпиги получает разрешение у великого герцога возвратиться в Болонью. Здесь он снова занимает в университете профессорскую кафедру.