В 20-е годы XV века выдающиеся русские художники Андрей Рублев и Даниил Черный украсили своими фресками и иконами Троицкий собор монастыря. В том же столетии в монастыре работал резчик и ювелир Амвросий. Среди талантливых зодчих, обстраивавших крепость, был и Василий Ермолин. Этот перечень славных имен свидетельствует о том большом значении, которое принадлежало Троицкому монастырю в развитии русской национальной культуры.
В XVI веке земельные владения Троицко-Сергиева монастыря, а также денежные богатства росли с необычайной быстротой. В основном это шло за счет развивавшейся торговли хлебом, рыбой, солью. Правительство давало монастырю большие торговые льготы. Свои продукты монахи сбывали в Новгороде, Великом Устюге, Белоозере. Даже английские купцы отмечали, что в торговых делах в России монахи превосходят светских купцов.
Значительные богатства продолжали поступать в монастырь и за счет погребения на его территории знатных лиц из княжеских и боярских родов. В 1561 году в монастырь приезжал Иван Грозный для совета с троицким духовенством перед организацией опричнины. Заручившись поддержкой монастыря, он уехал в Александровскую Слободу. За годы опричнины значительно выросли земельные владения монастыря за счет земель опальных землевладельцев, а его казна пополнилась вкладами по казненным.
В годы правления Ивана Грозного Троице-Сергиеву монастырю уделялось большое внимание как военно-стратегическому пункту на северных подступах к Москве. Это было время, когда многочисленные монастыри превращались в опорные пункты и военные крепости. С 1540 по 1550 годы в монастыре велось крупномасштабное строительство крепостных стен. Монастырские крестьяне получили разрешение бесплатно брать строительный материал, на чьих бы землях он ни находился. Довольно быстро крепость Троице-Сергиева монастыря стала образцом русского фортификационного искусства своего времени. При этом мощная крепостная стена с башнями поражала не только своей неприступностью, но величественной красотой.
Через несколько десятилетий эти фортификационные сооружения подверглись суровому испытанию. В 1604 году польско-литовские князья, воспользовавшись сложной обстановкой в России, выдвинули в качестве своего ставленника на русский престол самозванца Лжедмитрия I и вторглись в пределы России. Когда народ свергнул Лжедмитрия, появился второй самозванец, прозванный в народе «тушинским вором». Поляки блокировали Москву с юга и запада и стремились отрезать к ней подступы с севера, где в качестве первоклассной русской, хорошо вооруженной крепости, находился Троицкий монастырь. Здесь находился сильный отряд воинов под предводительством воевод Г. Долгорукова-Рощи и А. Голохвостова, посланный сюда царем для поддержки.