В белке PhoQ кишечной палочки это следующие четыре аминокислоты: аланин в позиции 284, валин в позиции 285, серин в позиции 288, треонин в позиции 289 (сокращенно Ala284, Val285, Ser288, Thr289 или еще короче – AVST).
Но AVST – лишь одна из 160 000 (20>4) возможных комбинаций четырех аминокислот. Ведь чисто теоретически на каждой из этих четырех позиций могла бы стоять любая из 20 аминокислот. Исследователи поставили перед собой амбициозную задачу откартировать все пространство последовательностей для данных четырех аминокислотных позиций. То есть для каждой из 160 000 комбинаций проверить, обеспечивает ли она нормальное взаимодействие PhoQ с PhoP, а значит, и правильную работу всей регуляторной системы.
Для этого были изготовлены плазмиды с геном phoQ, в котором триплеты нуклеотидов, кодирующие аминокислоты белок-белкового интерфейса AVST, были полностью рандомизированы, то есть заменены на случайные тройки нуклеотидов. Затем эти плазмиды вставили в клетки E. coli, из которых их собственный ген phoQ был заблаговременно удален. Кроме того, в геном подопытного штамма вставили ген желтого флуоресцирующего белка под управлением такой регуляторной последовательности, которая обеспечивает активацию этого гена в присутствии активной формы белка PhoP (чтобы клетки, в которых система PhoQ-PhoP сработала, можно было отличить по флуоресценции). В итоге получилась разношерстная популяция кишечных палочек, у каждой из которых в белке PhoQ на месте четырех аминокислот AVST находилась какая-то из 160 000 возможных аминокислотных комбинаций.
Теперь нужно было выбрать из этой популяции те клетки, у которых система PhoQ-PhoP по-прежнему исправно работала. Отбор проводился в два этапа. Сначала микробов выращивали при разных концентрациях ионов магния и отбирали тех, у которых интенсивность желтого свечения соответствовала таковой у контрольных бактерий с последовательностью AVST. Затем отобранных микробов помещали в среду, не содержащую ионов магния. Пережить такое “магниевое голодание” способны только бактерии с исправно работающей системой PhoQ-PhoP.
Геномы бактерий, выдержавших эти испытания, подвергли секвенированию, чтобы получить полный список аминокислотных последовательностей, обеспечивающих нормальную работу системы PhoQ-PhoP. Таких последовательностей оказалось неожиданно много: целых 1659. Ученые выборочно проверили некоторые из мутантных штаммов на способность конкурировать с контрольными кишечными палочками при разных концентрациях ионов магния. Эти эксперименты показали, что приспособленность мутантов осталась на том же уровне, что и у исходного штамма. Таким образом, по крайней мере некоторые (а скорее всего, большинство) из выявленных 1659 последовательностей не имеют серьезных дефектов по сравнению с исходной последовательностью AVST.