В конце того же года граф Эссекс разработал новый план антииспанской экспедиции, целью которой являлось уничтожение вражеских кораблей в Эль-Ферроле и захват «серебряного флота». Рэли взял на себя всю тяжесть подготовки экспедиции. 10 июля 1597 года флот вышел в море в составе 4 эскадр: главнокомандующий Эссекс вел 11 судов; вице-адмирал Томас Хоуард – 8; контр-адмирал Рэли – 8 военных судов, 10 транспортов и 20 барок; у союзников-голландцев было 10 судов. Однако захватить «серебряный флот» не удалось.
После смерти королевы Елизаветы (24 марта 1603 года) король Яков I Стюарт заподозрил Рэли в заговоре и упрятал его в Тауэр. 17 ноября состоялся суд; Рэли был обвинен в государственной измене и приговорен к смертной казни, но экзекуция была отложена на неопределенное время. Тринадцать долгих лет он провел в Тауэре, ведя весьма активную жизнь: проводил различные физические и химические опыты, разрабатывал проекты создания постоянных колоний за океаном, писал трактаты по кораблестроению и навигации и «Историю мира» в 5 книгах. Зная, что король нуждается в деньгах, Рэли разработал план новой экспедиции в Гвиану, и обещал предоставить Якову I несметные богатства Эльдорадо. 19 марта 1616 года Тайный совет сообщил ему, что король поддержал «гвианский проект». Началась подготовка экспедиции. В ее организацию было вложено 30 тыс. фунтов стерлингов, из которых треть внес сам Рэли.
В июне 1617 года флотилия Рэли покинула Плимут. Двигаясь на юг, англичане миновали берега Португалии и Марокко и в начале осени посетили Канарские острова. Оттуда корабли пошли к островам Зеленого Мыса, а в ноябре подошли к берегам Южной Америки. Отдохнув в Кайенне, они в декабре прибыли к устью р. Ориноко. На поиски Эльдорадо был отправлен отряд из 400 человек во главе с Лоуренсом Кеймисом. Ожидая его возвращения, Рэли в январе 1618 года послал на Тринидад корабль под командованием Джона Ферна, чтобы купить там табак и продовольствие.
Вскоре от индейцев удалось узнать о нападении отряда Кеймиса на испанский город Сан-Томе. Город был взят штурмом, разграблен и сожжен. При этом в стычке с испанцами погиб сын Рэли – Уот.
Провал экспедиции и смерть сына были для Рэли страшным ударом. На кораблях назревал бунт. Моряки советовали своему командиру заняться пиратством в Вест-Индии. Но Рэли решил возвращаться на родину.