Находясь на Новгородской кафедре, святитель Макарий приступил и к главному труду своей жизни, оставшемуся в церковной истории неразрывно связанным с его именем и послужившему не одному поколению русских православных людей, – составлению Великих Четьих Миней, получивших впоследствии название Макарьевских.
Традиционные четьи минеи – то есть «собрание текстов для чтения на каждый день месяца» – представляли собой сборники душеполезных текстов, в основном житий святых, собранных воедино и расположенных в соответствии с днями года. В то время по Руси ходило множество самых разных списков житий и духовной литературы; списки эти были разрозненными, несистематизированными, нередко в текстах встречались ошибки и неточности… Заботясь о просвещении и духовном назидании своей паствы и вообще всего православного люда, святитель Макарий решил приняться за поистине титанический труд: собирание воедино, исправление и должную систематизацию не только житий святых, но и вообще всех православных произведений церковно-повествовательного и духовно-учительного характера, существовавших в те годы на славянском языке.
В Великие Макарьевские Четьи Минеи вошли как произведения греческих, латинских и ближневосточных богословов, переведенные на славянский язык, так и творения собственно древнерусских церковных писателей: «Слово о Законе и Благодати» митрополита Илариона, труды епископа Кирилла Туровского, иеромонаха Пахомия Серба и многих, многих других. Святоотеческие и богословские творения были расположены в соответствии с днями каждого месяца, тут же помещались жития святых, чья память праздновалась в этот день. В конце Миней были помещены различные сборники душеполезных изречений и повествований: «Златоструй», «Пчела», «Маргарит» и другие. Все тексты, вошедшие в Великие Четьи Минеи, не просто собирались и переписывались, но и тщательно редактировались с учетом древних греческих и славянских текстов, благо в Великом Новгороде были богатые библиотеки, и недостатка в материалах для работы у святителя Макария и его помощников не было.
Напряженная работа над составлением Великих Четьих Миней заняла у святителя Макария больше двадцати лет. Начав ее на Новгородской кафедре, святитель продолжил свои просветительские труды в Москве, митрополитом которой был избран в 1542 году. Святителю в это время было уже около шестидесяти лет.