С течением времени военные угрозы с различных сторон становились для Гродненского княжества всё более явными. В XIII веке, на территориях так называемой Чёрной Руси, завязываются военные столкновения между галицко-волынскими князьями и литовским нобилем Миндовгом. Центром этих событий в летописях показан Новогородок, но и реже упоминаемый Гродно был ареной противостояния литовцев и галичан.
После образования Великого княжества Литовского Гродно вошёл в его состав. Из-за скудности источников, касающихся этого периода, многим исследователям представляется невозможным определение конкретной позиции города в иерархии населённых пунктов нового государства, продолжавшего формироваться.
По одной из гипотез: гродненским князем был выдающийся полководец и будущий великий князь литовский — Тройдень, который после занятия трона Литвы, с помощью гродненской дружины, повоевал Дрогичин. Активная борьба за Гродно между силами Тройденя и галицко-волынскими войсками безусловно свидетельствует о важности наднеманской крепости.
В конце XIII века начинаются нападения на Гродно крестоносцев. С огромным упорством лучшее европейское рыцарство осаждает гродненские укрепления. Город, являвшийся ключом к Понеманью и важным политическим центром, привлекал рыцарей на протяжении более чем 100 лет.
Герб первого великого магистра Тевтонского ордена, Генриха Вальпот фон Бассенхайма.
В первой половине XIV века начальником гродненского замка становится лучший полководец ВКЛ – Давыд, имя которого неразрывно связанно с Гродно. Князь Давыд Городенский успешно воевал против крестоносцев. В литературе даже отмечается, что он был непобедим в битвах с воинствующими монахами, что, правда, не вполне соответствует действительности.
Во второй половине XIV века гродненским правителем являлся молодой сын великого князя Кейстута – Витовт. Будущий великий князь литовский, за свои достижения прозванный Великим, был именно гродненским князем ещё до восшествия на великокняжеский престол. Витовт не раз боролся за город, то вступая в союз со своим «заклятым братом» Ягайлой, то объединяясь с крестоносцами против этого опасного родственника. Особенно выделяется в ряду межродственных боевых столкновений осада войсками Ягайло гродненских укреплений, произошедшая в 1390 году. Она была длительной и упорной, и завершилась взятием Нижнего и Верхнего гродненских замков. Однако уже в следующем году Витовт отбил город. Вскоре братья примирились и Витовт предал союзных ему крестоносцев, которые в отместку организовали поход на столицу князя отступника – Гродно.