По окончании академии, во время войны с Турцией (1877), был командирован на театр военных действий, где исполнял обязанности ординатора в военном госпитале. По возвращении с войны, в 1878 году, был прикомандирован к клиническому военному госпиталю для усовершенствования и работал ассистентом, а затем ординатором в терапевтической клинике. В 1881 году Афанасьев защитил докторскую диссертацию, был избран по конкурсу стипендиатом барона Виллие и командирован за границу (Германия, Франция и Англия) для подготовки к профессорской деятельности. Результатом этой поездки был ряд научных работ по бактериологии и внутренней медицине. В 1885 году Афанасьев избран приват-доцентом кафедры патологической анатомии ВМА. Вскоре Афанасьев получил профессуру в Клиническом институте великой княгини Елены Павловны, а в 1889 году возглавил этот институт. Одновременно он состоял профессором Николаевского военного госпиталя и консультантом Санкт-Петербургской Максимилиановской лечебницы. В этот же период некоторое время заведовал отделом медицинской микробиологии в ИЭМ.
Последующий период жизни Афанасьева до самой его смерти заполнен преподавательской деятельностью и врачебной практикой. Афанасьев был исключительно популярен как врач.
В работе, выполненной Афанасьевым совместно с Павловым, авторы показали задерживающее влияние на секрецию поджелудочного сока атропина, а также раздражения чувствительных нервов.
Наиболее выдающимися в деятельности Афанасьева являются работы последующего периода, периода занятий патологией и бактериологией. Афанасьев издал «Лекции по клинической микроскопии и бактериологии». Как профессор-бактериолог, он создал русскую школу врачей. Из его клиники и бактериологической лаборатории, созданной по его инициативе впервые в России, вышло до 50 научных работ и диссертаций.
Афанасьев был известен как редактор и издатель двух распространенных медицинских журналов: «Современная медицина и гигиена» и «Терапевтический вестник». Он был также одним из редакторов «Реальной энциклопедии медицинских наук».
Афанасьев умер в Мургабе (Туркмения) в апреле 1910 года от хронического нефрита.
Работы[2]: Об окончании нервов в органах осязания у рыб. Канд, дисс., Зап. имп. Акад, наук, XXV, 1875, прилож. № 8, 1; (с И. П. Павловым) Beitrage zur Physiologie des Pancreas. Pfl. Arch., 16, 1877, 173; О секреторных нервах поджелудочной железы. ВМЖ, ч. CXXIX, 1877, отд. 2, 231; Об иннервации отделения желчи с некоторыми указаниями на происхождение желтухи. Дисс., СПб, 1881; К вопросу о сгорании сахара в теле. Врач, 1881, № 17, 273; Об анатомических изменениях в печени под влиянием гликогено- и желчеобразовательной деятельности. Врач, 1883, № 3, 35; см. также: Pfl. Arch., XXX, 1883, 385; Ueber Hamoglobinamie und ihre Folgen. Verh. Congr. inn. Med., 1883; О патолого-анатомических изменениях в почках и печени при некоторых отравлениях, сопровождаемых гемоглобинурией или желтухой. Врач, 1883, №№ 23 и 24, 357; О третьем форменном элементе крови в нормальном и патологическом состояниях и отношении его к возрождению крови. Врач, 1884, №№ 16–18 и 19, 270, см. также: Arch. kl. Med., 35, 1884, № 3–4, 17; О новом способе непосредственного переливания крови: переливание крови, подвергнутой влиянию пептона. Врач 1884 №№ 24 и 26, 395.