Белок Cas9 работает как нуклеаза, разрезая ДНК в точке, указанной направляющей РНК. Cas9 включает два домена, отвечающих за активность нуклеазы и взаимодействие с РНК. Когда комплекс направляющей РНК и Cas9 находит целевую последовательность, Cas9 создает разрыв в ДНК, активируя механизм репарации, которым организм восстанавливает повреждённую цепь. На этом этапе включается механизм, известный как «неконсенсусная репарация», когда клетка не способна точно восстановить разрыв. Это создает возможность для внесения необходимых мутаций или вставок.
Важно отметить, что точность системы может изменяться в зависимости от выбранной последовательности направляющей РНК и контекста генома. Для повышения специфичности ученые также ищут новые методы, например, используют модифицированную версию Cas9, которая не создает разрывов в обеих цепях ДНК и помогает избежать нежелательных изменений вне целевого участка. Эффективность редактирования можно улучшить, оптимизировав протоколы трансфекции и методы доставки CRISPR-систем в клетки. Например, использование векторов на основе аденовирусов продемонстрировало высокую эффективность в доставке CRISPR в специфические типы клеток.
Однако, несмотря на свои плюсы, CRISPR-Cas9 имеет и недостатки. Правильное использование этой технологии требует тщательного анализа возможных нецелевых эффектов – ненамеренных изменений в геномах. Для их снижения можно проводить предварительное скринирование, основываясь на анализе данных о специфичности направляющей РНК. Например, группа, работающая с человеческими клетками, может использовать инструменты, такие как CRISPR-Seek, для предсказания возможных нецелевых мест и минимизации рисков. Применение анти-CRISPR белков, блокирующих активность Cas, также рассматривается как способ уменьшить нежелательные эффекты.
Далее, разработка более совершенных систем редактирования, таких как CRISPR/Cas12 и CRISPR/Cas13, открывает новые горизонты возможностей. Эти молекулы обладают улучшенными характеристиками, такими как повышенная специфичность и возможность редактирования РНК, что особенно полезно, когда требуется временное изменение экспрессии генов. При проведении экспериментальных исследований важно использовать строгие контрольные группы для оценки эффективности редактирования.