В мае 1789 г. он приступил к учреждению лож Египетского масонства в Риме, причем, по городу разносились возмутительные слухи о ее намерениях обратить в масонство самого Папу. Восставший народ захватил Бастилию 14 июля 1789 г., и католическая церковь Франции тоже пала под ударами Революции, в чем многие винили именно масонов. Учитывая сложившуюся в то время общую атмосферу, а также, и особенно, подозрение, родившееся в обществе, что следующая на очереди – Италия, а также принимая по внимание ранее изданные Папой буллы против масонства, вряд ли стоит удивляться тому, что Римская Церковь уделяла масонству повышенное внимание и была крайне чувствительна к любым проявлениям его деятельности.
Местные власти были более чем просто встревожены предприятиями приезжего Великого Мага, и Инквизиция арестовала его в День Св. Иоанна Евангелиста, 27 декабря 1789 г., и поместила в замок Сент-Анджело. Прославившийся своим хитроумием Калиостро вряд ли поступал в соответствии с ним, занимаясь своим уставом прямо в тени ватиканских стен, хотя вполне может быть и так, что здесь он дал волю своему предельному эгоизму и даже помыслить не мог о том, что кому-то будет дело до него и до его занятий посреди огромного и многолюдного города. Также говорят, что о его ложах донес Инквизиции кто-то из его ближайшего окружения, даже, может быть, его жена, в то время как другие настаивают на версии о засланном к нему Ватиканом шпионе-провокаторе.
Оправдание Калиостро Парламентом по делу об афере с ожерельем горько опечалило Людовика XVI, и он постарался задействовать все влияние своего двора во всей Европе, чтобы сделать жизнь мага невыносимой или, по крайней мере, максимально нелегкой. Вследствие этого политические преследования гнали Калиостро из города в город и в конечном итоге привели в застенки Иквизиции. К материалам инквизиторского «дела» постоянно добавлялись все новые опубликованные в разных странах разоблачительные памфлеты и данные о «расследованиях». Как славен и превознесен он бы ни был раньше, после дела об ожерелье жизнь его покатилась под откос, и римское инквизиторское следствие стало просто последним актом этой богатой событиями драмы.
«Суд» над ним был в действительности объявлением Римской Церковью войны, предупреждением с ее стороны, что она не собирается мириться с существованием масонства ни при каких обстоятельствах. Один из историков назвал «Жизнь Жозефа Бальзамо», вышедшую из-под пера автора-инквизитора, впервые официально заявившего о связи между Бальзамо и Калиостро, не просто биографическим трудом о Калиостро, а публицистической атакой на масонство как таковое. Поскольку Бальзамо был всем известен как отпетый мошенник, инквизиторам было очень удобно признать эту связь неоспоримой, так это было в действительности или нет. Так как мнение инквизиторов довольно предсказуемо, многие сомневаются в правдоподобности этой биографии, составленной автором, который, что было доказано, по своей воле добавлял в нее при необходимости некоторые вымышленные подробности.