Как военно-транспортные машины ТБ-1 отметились на всех крупных учениях Красной армии в 1934–1935 гг. Постепенно их транспортная роль стала основной. Именно в транспортных частях ТБ-1 служили дольше всего. До 1938 года ими была вооружена дислоцировавшаяся под Ленинградом 22-я тбаэ, входившая в 3-ю бригаду особого назначения, предназначенную для воздушно-десантных операций.
В составе 95-го трао в Средней Азии с середины 1933 года числился один ТБ-1. Самолет активно участвовал в действиях против басмачей в Туркмении, причем служил не только для перевозок. Периодически самолет загружали мелкими бомбами для ударов по бандам, сосредотачивавшимся у населенных пунктов и колодцев. В конце 1930-х годов ТБ-1 имелись и в других транспортных частях и подразделениях, таких как 14-й и 15-й трао в ВВС ОКДВА, 8-й под Харьковом.
19-й отряд в Забайкалье среди других машин располагал двумя разоруженными ТБ-1, которые применялись для перевозки грузов из Читы к линии фронта во время боев на Халхин-Голе в мае – сентябре 1939 года.
Хотя ТБ-1 в качестве бомбардировщиков ни разу не применялись ни в одной войне, однако именно они позволили подготовить многочисленные кадры летного и наземного состава, а также отработать тактику боевого применения, технологию обслуживания многомоторных самолетов. На этих машинах прошли подготовку летчики, возглавившие затем огромные соединения тяжелых бомбардировщиков, ставших основной ударной силой ВВС РККА в середине 30-х годов.
Вообще стоит отметить, что если в количественном отношении прогресс в развитии советской тяжелобомбардировочной авиации был явным, то в тактическом и стратегическом плане места в структуре ВВС ей пока не было – советское командование просто не знало, как правильно применять всю эту армаду.
В начале 30-х годов во взглядах политического руководства страны произошел перелом и основой мощи ВВС РККА была признана дальнебомбардировочная авиация. При этом ее основным оружием должны были стать гигантские бомбовозы. Это являлось отражение господствовавшей тогда в головах советских военачальников «глубинной» стратегии действий ВВС, которая подразумевала наступательные операции на чужой территории. Стремительные атаки танковых колонн должны были поддерживаться ударами авиации, парализующими вражескую оборону, и воздушными десантами, захватывающими ключевые объекты в тылу противника.