Эти факторы – бессилие короля Энрике, измены королевы Жуаны и сомнительность происхождения ее дочери Хуаны сделали вопрос престолонаследия вновь актуальным. Знать принудила короля Энрике назвать наследником своего младшего брата Альфонсо – Изабелла была средней по рождению. Король первоначально согласился, предполагая, что Альфонсо женится на его дочери Хуане Бельтранехе, но спустя некоторое время передумал. Кастильские кортесы, почувствовав в короле слабину, намеревались взять власть в свои руки, ведь шефство над молодым Альфонсо дало бы им большие возможности.
О низложении Энрике IV было объявлено в Пласенсии 27 апреля 1465 года, однако формальная церемония низложения была проведена 5 июня неподалеку от Авилы, в присутствии малолетнего инфанта Альфонсо. На большой, издалека видной платформе было выставлено деревянное чучело короля в черном одеянии, со скипетром и мечом в обеих руках. Дворяне зачитали перед чучелом длинный список обвинений, где фигурировали нежелание воевать с маврами, пристрастие к мужеложству и половое бессилие. Также было указано, что инфанта Хуана не может быть его дочерью и, следовательно, наследовать кастильский престол. По окончании речей с истукана сняли корону, сняли меч и скипетр, затем повалили чучело наземь с криком: «Ниц, содомит!». После этого спектакля на сцену поднялся инфант Альфонсо, и присутствовавшие принялись целовать отроку руки. Так началось восстание, в котором сам юный принц был не более чем пешкой или скорее знаменем, под которым собирались желающие власти или презирающие Энрике дворяне. Вся Кастилия разделилась на два враждебных лагеря: северные провинции были за Энрике, южные – за Альфонсо. Опираясь на ресурсы влиятельного семейства Мендоса, король в 1467 году дал сражение при Ольмедо и одержал победу. Но война продолжалась, и мятежники заняли Сеговию, где находилась инфанта Изабелла. Их остановила внезапная смерть Альфонсо в возрасте 14 лет (возможно, от яда). Надежды мятежных дворян сосредоточились на Изабелле. Но она отказалась принять корону при жизни брата, и мятеж временно затух.
После гибели Альфонсо Энрике по требованию знати заключил со своей сестрой Изабеллой договор у быков Гисандо, согласно которому она становилась его наследницей, причем король обязывался не принуждать ее к нежелательному для нее браку, а она обязывалась не выходить замуж без согласия брата. Король уже официально пренебрег своей предполагаемой дочерью Хуаной Бельтранехой, которую, в свою очередь, в 1475 году ее дядя, португальский король Альфонс V, взял в жены, чтобы закрепить свои притязания на Кастилию. Но брак был аннулирован Папой римским Сикстом IV из-за близкого родства.