Игумен Порфирий I (1521–1524) известен как смелый заступник за страждущих перед сильными мира сего. Во время его игуменства в темнице находился около двух лет внук Димитрия Шемяки путивльский князь Василий, которого оклеветали в связях с Литвой. Воспользовавшись приездом Василия III, благочестивый игумен сказал ему: «Если ты приехал сюда, в храм Безначальной Троицы, просить милости за грехи свои, буди сам милосерд над теми, которых гонишь ты безвинно, а если ты, стыдясь нас, станешь уверять, что они виновны перед тобой, то отпусти по Христову слову какие-нибудь малые динарии, если сам желаешь получить от Христа прощения многих талантов» [55, с. 354]. За такое смелое ходатайство Порфирий был лишен игуменства, а затем даже заключен в тюрьму.
Следующий за Порфирием игумен преподобный Арсений Сахарусов управлял Троицкой обителью всего два года, после чего из любви к безмолвию удалился в вологодские леса, где основал два монастыря [28, с. 136].
С 1529 по 1539 г. игуменом Троицким был Иоасаф (Скрипицын). Он крестил двух сыновей Василия III, а спустя некоторое время участвовал в постриге самого великого князя, очень чтившего Преподобного Сергия и основанный им Троицкий монастырь. Это видно из слов великого князя, когда в конце жизни он, беспокоясь за судьбу малолетнего сына, сказал игумену Иоасафу: «Помолись, отец, о земном строении и о сыне моем Иоанне, и о моем согрешении: дал Бог и великий чудотворец Сергий мне вашим молением и прошением сына Ивана; я крестил его у чудотворца, вручил его чудотворцу и на раку чудотворцеву его положил, вам сына своего на руки отдал; так молите Бога, Пречистую Его Матерь и великих чудотворцев о Иване, сыне моем, и о жене горемычной». Далее великий князь просил Иоасафа быть при нем до конца: «А ты, игумен, прочь не езди, из города вон не выезжай» [99, с. 356].
Опасения Василия III были не напрасны. После его смерти (1533) при малолетнем Иоанне IV начался период безначалия, различных злоупотреблений и злодеяний, которыми особо отличались Шуйские. В это трудное время Русскую Церковь возглавил митрополит Иоасаф, бывший Троицкий игумен. Князь Иоанн Шуйский надеялся видеть в нем своего сторонника, но ошибся. Новый первосвятитель испросил свободу заточенному князю Ивану Федоровичу Бельскому, который сумел остановить грабежи и насилия. Благодаря ходатайству митрополита Иоасафа были освобождены из заключения еще несколько человек. Но Шуйские, недовольные таким положением дел, схватили Бельского и сослали в Белоозеро, где он был умерщвлен в 1542 г. Дети боярские и новгородцы, подстрекаемые Шуйскими, чуть не убили митрополита Иоасафа, который бежал от них в Троицкое подворье. И только Троицкий игумен Алексий удержал их именем святого Сергия от убийства. Впоследствии митрополит Иоасаф был сослан в Кирилло-Белозерский монастырь и оттуда переведен в Троицкий, где мирно почил 27 июля 1555 г. [107, с. 10].