Сделав смотр флотам, дон Хуан разработал организацию сил и дал подробные инструкции относительно походного и боевого строя. В бою 200 галер развертывались в строй фронта на ширину около 5 миль, причем так плотно, чтобы между судами не могли пройти неприятельские галеры. Расстояние между эскадрами составляло четыре ширины галер. 6 галеасов выстраивали впереди галер и размещали на них по 100 аркебузиров. Каждая эскадра отличалась цветом вымпелов (синий, зеленый, желтый и белый – для резерва). В походе дозор выдвигали вперед на 20 миль днем и на 8 – ночью. Арьергард держался в миле от главных сил. Был назначен начальник тыла для помощи отстающим судам; эту должность по очереди выполняли командиры арьергарда. Галеасы составляли отдельный отряд, а грузовые нефы были выделены из построения, чтобы не задерживать перемещения.
Утром 7 октября 1571 года противники увидели друг друга. Союзники располагали 6 галеасами и 203 галерами. В сражении дон Хуан возглавил центр, тогда как левым флангом (53 галеры) командовал венецианец Барбарелло, а правым из 50 галер – генуэзец А. Дориа. На судах было до 80 000 человек, в том числе 25 000 солдат, вооруженных аркебузами. Венецианские галеасы были выдвинуты вперед, а позади центра, под командованием испанского адмирала Санта-Круса и сицилийского капитана Кардоны, был построен резерв (38 галер). Противостоящий турецкий флот включал до 230 галер и 66 галиотов. Али-паша построил суда традиционным полумесяцем.
Ядра турецких пушек давали все время перелеты, суда их пострадали от огня галеасов. Тем не менее турки вели бой решительно.
В центре два корабля дон Хуана сцепились с кораблями капудан-паши. Завязалась рукопашная схватка, длившаяся час. Турки не успели помочь своему флагману: Али-паша пал в бою от пули. Его корабль взял дон Хуан, поднял на нем свой флаг, а голову капудан-паши вздели на копье. Турецкие галеры гибли одна за другой.
Левый фланг долго сопротивлялся Андреа Дориа, но, зная о трудном положении центра, турки направились на помощь капудан-паше. Однако прибытие Андреа Дориа к месту боя стало решающим. Улудж-Али скрылся под покровом ночи. Турки потеряли 225 судов; из них 94 прибились к берегу и были сожжены, а остальные достались союзникам с 117 большими и 556 малыми пушками. Было пленены 3600 турок и освобождены 15 тысяч христиан. Потери членов лиги составили всего 15 галер и 8000 убитых. В значительной мере благодаря твердости и решительности доны Хуана была одержана полная победа. Гегемония турецкого флота на Средиземном море пала. Сражение при Лепанто стало последним крупным сражением гребных флотов на Средиземном море.