17 апреля 1792 года в 10 часов утра произвели первое испытание машины. На маленьком дворе тюрьмы Бисетр присутствовали врачи: Пинель, Кабанис, Гийотен, хирурги Луи и Кульерье (принимавший самое активное участие в изготовлении машины), руководство тюрьмы, прокурор-синдик Парижской коммуны, многие члены Национального собрания и т. д. Потомственный палач Сансон положил труп умершего в тюрьме заключенного на то место, куда упадет нож, и нажал кнопку, соединенную веревкой с ножом, который опустился с быстротой мысли. Пока зрители поздравляли двух медиков, изобретение которых делало смертную казнь более быстрой и менее мучительной, старик Сансон прозорливо заметил: «Прекрасное изобретение, только бы им не злоупотребляли, благодаря легкому способу убивать людей». Изобретенным механизмом первая казнь была совершена 25 апреля 1792 года на Гревской площади. Жертвой стал убийца Польтье.
После закрытия Национального собрания Гийотен оставил политическую деятельность и предался врачебной практике. Он открыто порицал революционные эксцессы, решительно выказывал антипатию к виновникам террора. Гийотен старался защищать жертвы террора. Так, в интересах своих друзей, преследуемых революционерами, обращался с просьбами к коллеге Марату, но тщетно, тот был непреклонен. По словам Soucerotte, Гийотен доставлял жертвам террора яд, который освобождал их, по крайней мере, от мук эшафота. Неудивительно, что при таком отношении Гийотен сам попал в немилость и угодил в тюрьму. 8 октября 1795 года был выдан ордер на арест доктора Гийотена. Ордер можно встретить в музее парижской префектуры полиции. Он сам едва не стал жертвой того орудия, идею о котором внушило ему чувство человеколюбия. Спасло его от смерти 27 июля 1794 года – день падения Робеспьера.
Освобожденный из тюремных застенков, он снова занялся врачебной практикой и добился статуса «Médicin de bienfaisance de la Halle de blé». Огромная заслуга Гийотена в том, что он занялся объединением врачей оставшихся от расформированного революцией прежнего медицинского факультета, а также докторов других факультетов и основал Свободное ученое общество (cerle médical), задача которого заключалась в совместной работе на благо медицины и для поддержки достоинства врачебного сословия. Это Свободное медицинское общество явилось колыбелью современной Академии медицины. Нельзя не сказать и о том, что Гийотен был ревностным защитником Дженнеровского оспопрививания; он был избран председателем вновь образованного французского комитета для распространения нового метода и немало содействовал развитию оспопрививания во Франции.