Здоровье царицы было подорвано частыми родами. Не дожив до тридцати лет, она скончалась 7 августа 1560 в селе Коломенском. По Москве ходили упорные слухи, будто ее извели завистники-бояре, которые покушались также и на самого царя. Допрашивая с пристрастием князя Воротынского, Иван выговаривал ему: "на тебя показывает слуга твой, что хотел меня очаровать и подговаривал к тому баб шепчущих". Недоверие и глубокая неприязнь к боярам навсегда поселились в душе царя.
Иван Васильевич сильно мучился и страдал о потере супруги. По свидетельству летописца, на ее похоронах царь рыдал и «от великого стенания и от жалости сердца» едва держался на ногах. Целую неделю после похорон Иван провел в одиночестве, когда же вновь появился на людях, окружающие с трудом узнали его. Тридцатилетний царь сгорбился, лицо стало желтое, морщинистое, ввалившиеся глаза горели безумным огнем. Смерть Анастасии Романовны послужила причиной первой кампании террора против бояр из ближайшего царского окружения. Между прочим, подозрения Ивана оказались не беспочвенными. В конце 1990-ых проведенная экспертиза обнаружила в останках Анастасии значительную концентрацию ртути.
Свою тоску и страдания безутешный вдовец принялся топить в жестоком разгуле: «Умершей убо царице Анастасии нача царь яр быти и прелюбодействен зело». Бояре затрепетали, ибо не знали как и подступиться к царю-батюшке, чтобы угодить ему и сохранить свою голову. Именно в их среде созрел план оженить Ивана еще раз: авось, остепенится да перестанет понапрасну кровь пускать. Против ожиданий, скоро выяснилось, что царь не возражал против новой женитьбы.
Попытки засватать сестру польского короля Сигизмунда II Августа не увенчались успехом. Тогда в 1560 посланцы царя Ф.В.Вокшерин и С.Мякинин отправились на Кавказ «у Черкаских князей дочерей смотрети». 15 июля 1561 в Москву была доставлена княжна Кученей (?-1569), дочь кабардинского князя Темрюка ("из черкас пятигорских девица"). 20 июля того же года она была окрещена по православному обряду митрополитом Макарием и получила имя Мария Темрюковна. 21 июля 1561 Иван Васильевич венчался с ней в Успенском соборе. Начиная с 1562 Мария неоднократно сопровождала царя в поездках по монастырям. 21 марта 1563 родила царевича Василия, который умер в двухмесячном возрасте.