Так до конца не разгадана загадка Большого собора, построенного в 1684–1698 годах по обету старшей сводной сестры Петра I царевны Екатерины Алексеевны. Вообще стесненные в средствах царевны редко решались на подобные траты, к тому же остается неизвестной и причина обета. Всегда интересовавшаяся архитектурой, особенно заботившаяся о внутренней отделке своих покоев в теремах, царевна Екатерина Алексеевна успевала подумать и о своих помещениях в Новодевичьем монастыре и – едва ли не главное для ее благополучия – никогда не раздражала Петра. Петр ни в чем не ограничивал старшую сестру, ни в чем ее не подозревал, охотно допускал ее жить в Петербурге.
В плане Большой собор имеет форму креста, середину которого представляет квадрат, а концы – апсиды. Благодаря такому решению зодчий получил возможность поместить четыре главы храма крестообразно, по сторонам света, что тоже свидетельствует о малороссийском влиянии. Из этих пяти глав, которыми увенчан собор, вызолочена только центральная, тогда как остальные покрыты ярью с медными позолоченными звездами.
В 1717 году собор был окружен крытой галереей со сводами и широкими двойными окнами. Впечатление монументальности храма в интерьере подчеркивается превосходным шестиярусным иконостасом конца XVII века, русской работы. Внутренняя роспись выполнена в 1782–1785 годах живописцем Антонио Клаудо по эскизам архитектора В. И. Баженова.
По окончании стены над северными воротами сооружается церковь Тихвинской Божией Матери, предположительно архитектором И. П. Зарудным (1713–1714), а с вступлением на престол Анны Иоанновны – колокольня над западными воротами (1730–1753), создание которой связывается с именами архитекторов Доменико Трезини, строителя Петропавловской крепости и одноименного собора в ней в Петербурге, И. И. Шеделя, известного по работам в Александро-Невской лавре, и московского зодчего А. П. Евлашева. Незадолго до Отечественной войны 1812 года в Донском монастыре строится церковь Архангела Михаила (1806–1809), служившая усыпальницей князей Голицыных, выдержанная в стиле классицизма.
Одним из знаменательных событий в истории обители становится Чумной бунт 1771 года, когда разъяренная толпа убила прятавшегося от нее на хорах Большого собора епископа Амвросия. Все началось с площади у Варварских ворот Китай-город, где висела икона Боголюбской Божией Матери. Во время бушевавшей эпидемии, ежедневно уносившей сотни жизней, священнослужители спустили икону и ежечасно служили около нее молебны, причем верующие толпами прикладывались к святыне. Один из образованнейших людей своего времени, епископ Московский Амвросий (в миру Зертис-Каменский), богослов и духовный писатель, распорядился снова поднять икону, за что и подвергся нападкам народа. Его тело было растерзано (прах епископа покоится в Старом соборе). В память же избавления Москвы от чумы, в котором принял участие специально присланный императрицей Екатериной II Григорий Орлов, установился обычай ежегодно 15 июня служить перед иконой благодарственные ночные молебны.