Все эти неудачи только разжигали в душе Анны Марии Луизы обиду и бунтарский дух. Разочаровавшись в придворных интригах вокруг её замужества, Анна Мария Луиза обратила энергию в другое русло – она ввязалась в политическую борьбу на стороне оппозиции. В конце 1640-х годах Францию потрясла серия мятежей знати против регентства Анны Австрийской и кардинала Мазарини, известная как Фронда.
Отец Анны, герцог Гастон Орлеанский, постоянно плёл заговоры против королевской власти, и дочь во многом унаследовала его независимый нрав. В 1651 году 24-летняя Мадемуазель примкнула к Фронде принцев, встав на сторону своего двоюродного брата, принца Конде, против королевского правительства. Девизом Анны стало противостояние ненавистному Мазарини, которого она считала виновником всех своих несостоявшихся браков.
Активность Великой Мадемуазель в годы Фронды превзошла все ожидания современников. Она проявила себя не просто как сочувствующая принцам принцесса, но и как участница боевых действий.
В марте 1652 года Анна лично возглавила отряд, занявший для мятежников город Орлеан, после того как колеблющийся Гастон не решился туда отправиться. Когда городские власти Орлеана сперва отказались впустить её, опасаясь гнева короля, отважная принцесса нашла способ проникнуть за стены: по преданию, она добралась до городских ворот через ров по сходням из лодок, после чего жители, восхищённые её настойчивостью, встретили её как героиню.
Но самым громким эпизодом стал её поступок летом того же года. 2 июля 1652 года, во время сражения при предместье Сен-Антуан под Парижем, Великая Мадемуазель поднялась на бастионы крепости Бастилия и приказала развернуть пушки крепости против королевских войск, чтобы спасти армию принца Конде от разгрома. По её приказу батареи Бастилии открыли огонь по королевской армии, прикрывая отступление мятежников в город.
Благодарный принц Конде признавал, что именно решительные действия кузины спасли его от гибели. Этот дерзкий шаг, равносильный вооружённому выступлению против самого короля, шокировал придворное окружение. Мазарини, услышав о выстрелах Бастилии, мрачно заметил: «Этот пушечный залп убил её отца», намекая, что Гастон Орлеанский поплатится за выходку дочери. Так и произошло – сразу после подавления Фронды королевский двор сурово обошёлся с бунтовщицей.